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药物发明
Drug discovery
药物发明

高通量筛选服务

尊龙凯时生物学和药理学部提供高通量筛选服务，我们拥有强盛的级联筛选小分子抑制剂、体外的酶活性和细胞活性检测开发，以及高通量筛选剖析能力。

我们的生物部拥有凌驾 3000 种化合物的库，化合物筛选能力可以是 200x384 孔板/周，也可以凭证客户的需求举行定制。同时我们与 Selleck、MCE、Tocris和TargetMol 等提供化合物库的相助同伴亲近相助。

高通量筛选手艺简介

  • 高通量筛选(HTS)是药物发明中的一个要害手艺，用于从化合物库中识别可能成为药物化学优化的候选化合物。该手艺系统应用了药理学手艺、分子生物学手艺、细胞生物学手艺、盘算机手艺、治理手艺以及自动化控制手艺等，实现了药物筛选的快速、高效、微量化、自动化和规�；�。

    随着高通量筛选手艺的生长，可以越发快速高效地筛选大宗化合物，从而加速药物发明的速率。尊龙凯时生物学和药理学部提供高通量筛选服务，我们拥有强盛的级联筛选小分子抑制剂、体外的酶活性和细胞活性检测开发能力。

    尊龙凯时的高通量筛选服务可以做：级联筛选小分子抑制剂；体外酶活性测定；体外细胞活性测定；高通量筛选剖析等。

    药物发明中的高通量筛选历程涉及筛选大型化合物库，以找到影响生物靶点的潜在候选化合物。这些候选化合物通常被称为“苗头化合物”[1]。尊龙凯时生物部拥有凌驾 3000 种化合物的库，化合物筛选能力可以是 200x384 孔板/周，也可以凭证客户的需求举行定制。同时我们与 Selleck、MCE、Tocris和TargetMol 等提供化合物库的相助同伴亲近相助。

    高通量筛选历程可以通过种种要领来实现，包括读板器以及响应的软件来处置惩罚和剖析所获得的数据。一旦发明这些潜在的“苗头化合物”，对高通量筛选数据的进一步剖析还可以提供有关第一轮筛选时代获得的这些“hits”的潜在优化的信息[1]。

级联筛选—小分子化合物抑制剂

  • 级联筛选是药物发明历程中识别和选择先导化合物系列的一套测定要领，作为一种多条理的生物化学或药物研究要领，通常用于筛选药物或化合物库以寻找潜在的药物先导化合物。这种要领涉及多个生物学活性的级别，以便筛选潜在的药物目的。在这个历程中，可能会发明一些具有潜力的"先导化合物"，这些化合物可以进一步开发成为新药物。

    级联筛选—小分子化合物抑制剂.png

    开发小分子抑制剂需要强盛的级联筛选，来有用地识别与靶卵白团结的化合物，确定对不需要的相关卵白的选择性，并在下游功效测定中证实活性。

    靶标验证、剖析开发、二次筛选、ADME/Tox 和先导化合物优化等领域越来越多地使用 HTS 手艺。

体外酶活性检测

  • 酶活性的转变可以快速调理机体的心理功效或病理历程，激酶、卵白酶和肽酶是最常见的药物靶点。使用酶活性剖析手艺可以快速、高效地评估化合物对目的酶的抑制能力，从而筛选出具有潜力的候选化合物。

    体外酶活性检测.png

    酶活性检测的要领包括酶反应的底物、产品等，反应大多在均相的情形下举行。底物还原丈量（ATP、NAD/NADP、SAM、乙酰辅酶A、肽、DNA、RNA 等）- Down 测定产品丈量 - Up 测定

  • 酶活性检测- 案例 1

    HTRF 测定-均相时间区分荧光
    HTRF 测定-均相时间区分荧光.png
    Donor=Eu and Tb
    Acceptor=XL665
    优点：（1）特异性强，信号本底比（signal/background ratio）高；（2）荧光信号高度稳固；（3）反应均相，通量高。弱点：（1）特异性抗体本钱较高； （2）针对特定靶点需要开发特异性抗体。

  • 酶活性检测- 案例 2

    ADP-Glo 检测
    ADP-Glo 检测.png
    优点：(1) 迅速度高；(2) 可以检测激酶以外的酶。

  • 酶活性检测- 案例 3

    Z’-Lyte 检测
    Z’-Lyte 检测.png
    优点：(1)高信号本底比，高通量；(2)本钱低。弱点：(1)无法检测反应机制重大的酶；(2)难以评价自己有很强的自觉荧光的化合物；(3)检测卵白酶时会泛起假阳性数据。

  • 酶剖析要领开发- 要害因素

    酶剖析要领优化和验证常接纳酶滴定法、时间历程剖析、米式常数测定、DMSO耐受性、Z-prime 测试和化合物验证等。
    酶滴定和时间历程剖析.jpg
    酶滴定和时间历程剖析注：窗口（信号本底比）>3。
    米式常数测定.jpg
    ATP Km 和底物 Km注：选择靠近Km值的底物浓度
    DMSO耐受性.jpg
    DMSO耐受性：测试测定中可以耐受的最大DMSO浓度。注：DMSO 通常小于 1%
    Z-测试.jpg
    Z’：代表板的匀称性。σ=SD，μ=mean注：Z’>0.5 将作为酶法检测的 QC 标准
    化合物验证.jpg
    化合物验证：使用参考化合物来检测测试的重现性注：IC50应为已宣布值的5倍

    Plate layout：

    化合物验证-Plate-layout.jpg

    IC50 报告标准最大抑制百分比应大于 50%。最高值和最低值应在理论值的 15% 以内IC50 的 95% 置信限应在 2-5 倍规模内。

体外细胞活性检测

  • 细胞活性筛选是新药筛选中的常用要领，在细胞层面上评估化合物的活性和毒性，能够很好地模拟药物在体内的作用情形�；谙赴募觳庖言谥埔┬幸档囊┪锷秆≈姓加辛艘欢ǖ闹拔�。这些测定能够通过功效表征潜在药物靶标在细胞中的作用以及评估药物先导化合物的特异性和功效来评估潜在药物靶标[2]。尊龙凯时的体外细胞检测服务包括：
    表型测定：细胞增殖、迁徙、侵袭、凋亡、坏死性凋亡、自噬等。 功效测定：下游信号如卵白磷酸化、第二信使（Ca2+、cAMP、IP3、cGMP）。细胞中的卵白质-卵白质相互作用（PPI）：NanoBiT,NanoBRET,BiFC。
    表型测定.jpg

    表型测定

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    第二信使-Ca2+

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    卵白与卵白相互作用

  • 细胞检测开发 - 细胞毒性测试

    仅使用高通量筛选不可完全评估潜在药物，由于此评估还需要进一步举行毒性研究。相反，高通量筛选关于消除在研究对生物靶标影响很小或没有预期影响的化合物上铺张的时间至关主要。通过使用这种自动筛选历程，可以一起筛选数百万种化合物，并消除没有用果或效果差的化合物[1]。
    细胞毒性测试需要从细胞接种密度、作育时间、DMSO耐受性、Z-prime test、edge effect、化合物验证几个方面来思量。
    1. 细胞接种密度
    细胞活力>80%差别细胞密度的板中的种子细胞作育72~96小时，CTG/CCK8检测细胞活力在线性规模内选择 CTG/CCK8 信号的密度窗口（信号本底比）>2
    2. 作育时间
    选择优化的密度和种子细胞在差别时间点孵育细胞/化合物使用 CTG/CCK8 检测细胞活力具有最佳检测窗口和数据质量的时间点将用于进一步的实验窗口（信号本底比）>2
    细胞毒性测试-DMSO-tolerance.png
    3. DMSO耐受性
    差别剂量的DMSO与细胞孵育72至96小时，CTG法检测细胞活力注重：细胞检测中 DMSO 的含量通常低于 0.5%
    4&5. Z-prime test and edge effect
    QC标准：Z’>0.4，窗口>2通常边沿孔不会用于恒久作育
    Z-prime-test-and-edge-effect.jpg
    细胞毒性测试-化合物验证.jpg
    6. 化合物验证
    阳性化合物应为参考数据的 5 倍
    Plate layout：
    细胞毒性测试-Plate-layout-1.jpg
    细胞毒性测试-Plate-layout-2.jpg

高通量筛选剖析

  • 高通量筛选剖析流程图

    高通量筛选依赖自动化来快速测试大宗化合物，高通量筛选中天生的大宗数据需要强盛的数据处置惩罚和剖析工具。专门的软件和算法可以用于处置惩罚、剖析和可视化效果，使研究职员能够识别潜在的“苗头化合物”或体现出所需活性的化合物。
    1. 测定优化（Z’、测定窗口、DMSO 耐受性、参考化合物测试）2. 将首先对数千种化合物举行试点研究以测试该测定法3.还将建设正交测定法以消除假阳性化合物4. 对数以万计的化合物运行 HTS5. 掷中率通�；嵘柚梦�0.1%到0.5%
    高通量筛选加速了药物发明历程，使其更具本钱效益和效率，使研究职员能够快速筛选多种化合物，从而镌汰识别潜在候选药物所需的时间。HTS 通常是一个迭代历程，包括多轮筛选、掷中验证和先导化合物优化。研究职员凭证早期筛选的效果和履向来完善他们的化合物库和测定要领。

  • 高通量筛选-案例

    PSMA:
    前线腺特异性膜抗原（PSMA）是治疗晚期前线腺癌（PC）和种种实体瘤的有希望的靶标。只管 PSMA 靶向放射性药物治疗 (RPT) 已实现显着的成像和前线腺特异性抗原 (PSA) 反应，但积累的临床数据最先展现某些局限性，包括无反应者亚组、复发、放射诱导毒性和 需要专门的治理设施。迄今为止，使用 PSMA 通过抗体、纳米药物或细胞疗法治疗 PC 的非放射性实验已取得一定乐成。 我们开发了高通量 PSMA 酶测定法来判断新的 PSMA 调理剂。
    底物滴定.jpg

    底物滴定

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    参考化合物测试

    Z 因子测试和剖析窗口测试
    Z-因子测试和剖析窗口测试-1.jpg
    Z-因子测试和剖析窗口测试-2.jpg
    使用384孔板举行测定验证，四块板的数据显示Z因子高于0.5，测定窗口高于10倍。
    苗头化合物识别
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    苗头化合物识别-2.jpg
    总共使用100 x 384孔板筛选了30,000多种化合物，并在10天内完成，当将PSMA活性抑制设定为50%时，掷中率约为0.8%。

总结

  • 尊龙凯时拥有强盛的化合物检测开发和化合物筛选能力。我们的筛选能力可以是 200x 384 孔/周，或凭证客户的需求举行定制。样品是高通量药物筛选的物质基础，样品库泉源的化学多样性是决议高通量筛选手艺能否乐成的要害因素之一。我们与 Selleck、MCE 和 Tocris 等提供化合物库的相助同伴亲近相助，内部拥有凌驾 3000 种化合物的库。

附录

  • 来自 MCE（第三方供应商）的化合物库

    化合物库名称规格和货号形貌
    50K 多样性库50K  HY-L901该库中的化合物通过相异性搜索（谷内情似性系数为 0.52）举行选择，以提供更高的多样性和更普遍的化学空间笼罩规模。
    UORSY筛选库680K  HY-L0103VUORSY 筛选化合物库包括约 680,000 种化合物。 该文库是通过聚合合成要领构建的，提供了高度多样化的化学结构。 库中凌驾85%的化合物具有类药的理化性子，凌驾35%的化合物具有“lead-like”的性子。
    生物活性化合物库 Plus20K  HY-L001P? 生物活性和清静性经临床前研究和临床试验证实。有些已获得 FDA 批准。
    ? 普遍应用于癌症、干细胞、神经信号、免疫等研究重点领域。
    多肽库1.1K  HY-L105? 包括生物活性肽、氨基酸衍生物和关闭肽。
    ? 多肽药物发明和疫苗开发的有用工具。
    1,000万虚拟类药多样库10M  HY-L912VMCE 的 40,662 个 BB，涵盖约 273 种反应类型，天生了凌驾 4000 万个分子。选择切合 Ro5 标准的化合物。移除掉不适当的化学结构，例如 PAINS 基序和合成上难以获得的结构。 基于摩根指纹图谱举行分子聚类剖析，提取靠近每个聚类中心的分子，形成类药物且可合成的多样性库。
    这些选定的分子拥有 805,822 个奇异的 Bemis-Murcko 支架 (BMS)，具有多样化的化学空间。 强烈推荐该库用于基于人工智能的先导化合物发明、超大规模虚拟筛选和新的先导化合物的发明。
    膜受体靶向化合物库4.2K  HY-L150? 4333种膜受体靶向化合物奇异荟萃。
    ? FGFR、TRP 通道、VEGFR、TNF 受体、阿片受体、5-HT 受体、离子通道等靶点。
    片断化合物库22K  HY-L032? 奇异的21965 个片断化合物荟萃，用于通过高通量筛选(HTS) 举行古板先导化合物判断。
    ? 基于片断的药物发明要领(FBDD) 的有用工具。
    中药单体化合物库2.7K   HY-L065? 奇异的2712 种中药活性化合物荟萃，用于高通量筛选(HTS) 和高内在筛选(HCS)。
    ? 库中的化合物包括糖类和糖苷、苯丙素、醌类、黄酮类、萜类和糖苷、类固醇、生物碱、酚类、酸类和醛类。
    这些库可在 MCE（MedChemExpress，第三方供应商）中找到， 我们可以与 MCE 相助使用它们。 我们拥有的一个是中药单体化合物库。

  • 来自 Targetmol（第三方供应商）的化合物库

    名称规格及货号简介
    2600万虚拟筛选库26M由Targetmol整理的开源数据库，收录了全球主要的筛选化合物产品数据，包括万万级的化合物结构，致力于为全球科研职员提供一个稳固可靠的数据库。
    100K多样性预制化合物库100K & DS7000基于160万筛选化合物和130亿类药和类先导化合物的虚拟空间全心挑选而出，旨在提供新颖的化学结构。
    多样性焦点预制库50K & LF1000全心挑选50000种具有优良理化特征的类药分子，以较小的化合物数目实现结构多样性的筛选目的。这些化合物基于新合成的化合物荟萃，使用结构差别性要领筛选而出。
    EXP多样性库50K & CB1100基于50万类先导和类药化合物荟萃全心挑选而出，旨在提供多样的化学结构，并泛起出优异的类药和类先导特征，适用于多种研究目的使用
    药物靶点库53K & DO1200基于“靶点多样性”看法和现有数据，通过盘算机虚拟筛选、结构生物学、体外、细胞和表型展望等多种工具，对Chemdiv 160万个化合物举行筛选，获得5.3万个类药分子，涵盖200多个药物靶点。
    多样性焦点库Part150K & DF4500精选5万种化合物，笼罩160万种化合物的结构空间。该库在剔除PAINS、经由REOS和MedChem过滤器后，专注优化化合物结构的多样性。
    代表性焦点库（基于Bemis-Murcko Clustering算法）300K & DD3700基于Bemis-Murcko-clustering理论天生BMS骨架，经聚类剖析、类药性子剖析，获得的多样性库。
    DGK抑制剂库12K & L9920网络880余种DGK抑制剂分子作为模板分子，然后划分使用3D药效团建模和子结构搜索筛选/生物等排替换方法对160万小分子举行筛选构建而成。
    共价抑制剂库12K & DO2200Chemdiv共价抑制剂库旨在笼罩用作共价反应基团的常见弹头，另外从库存的砌块化合物中选取多样的特有和奇异结构作为扶引头，设计合成种种共价抑制剂。共价抑制剂通用库包括了种种常见的共价反应基团化合物。
    CNS MPO库30K & DP2250使用gMPO对Chemdiv 160万库存化合物举行筛选评估，选取评分不低于4的化合物；然后使用药化过滤器举行筛选，结构富集，最终获得此库。
    3D生物活性多样性库22K & D8800该库网络的小分子具有较好的焦点骨架结构、三维空间结构和药效团，展示出普遍的生物学活性，它们潜在的靶标包括酶、膜受体、转录因子、表观遗传调理剂、离子通道、转运卵白和其他卵白质，同时具有优异的ADMET性能。该库包括卵白质抑制剂/激活剂和受体激动剂/拮抗剂，活性化合物具有较低的分子量，较佳的LogP值和较佳的消融度。
    已知活性化合物库22K & L4010已知活性库是 22555 个具有生物活性，能引起细胞、组织甚至个体生物学反应的化合物的荟萃。包括了正在举行临床前研究的药物分子，临床期的药物分子和已经上市的药物。靶点明确，信息周全，很是适合完成药物功效重定位、小分子诱导细胞分解以及机制研究中卵白靶点确认等科研事情。
    自然产品库4533 & L6000TargetMol自然产品库精选了4533 种自然产品单体，这些自然产品单体泉源富厚，结构多样，具有很强的代表性。它们保存于三千余种中草药植物、动物以及微生物中提取纯化的自然泉源中，涵盖了五百余种差别骨架结构和千余种靶点受体，大部分因素都抵达比照品纯度。不但云云，库中还包括了众多单价极高的有数自然产品，性价比高。
    这些库可在Targetmol（TargetMol Chemicals，第三方供应商）中找到， 我们可以与TargetMol相助使用它们。
  • 参考文献：
    [1] Coma, I. et al. Process validation and screen reproducibility in high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 14, 66–76 (2009).doi: 10.1177/1087057108326664
    [2] Pawe? Szymański, Magdalena Markowicz,* and El?bieta Mikiciuk-Olasik. Adaptation of High-Throughput Screening in Drug Discovery—Toxicological Screening Tests. Int J Mol Sci. 2012; 13(1): 427–452.Published online 2011 Dec 29. doi: 10.3390/ijms13010427
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